Metodi di osservazione di routine e precauzioni di coltura cellulare
Metodi di osservazione di routine e precauzioni di coltura cellulare
Dopo che le cellule sono state inoculate o subcoltivate, lo sperimentatore dovrebbe effettuare un esame di routine delle cellule ogni giorno o al massimo 1 ~ 2 giorni. Osservare la morfologia e la crescita delle cellule, nonché il cambiamento del pH della coltura, se c'è inquinamento, ecc. In base ai cambiamenti dinamici delle cellule, eseguire la sostituzione dei liquidi o il trattamento del passaggio. Se si riscontrano condizioni anomale, prendere le misure in tempo.
1. Le cellule con un buon stato di crescita morfologico possono essere viste al microscopio generale, con ampia trasparenza, forte rifrazione e contorni poco chiari. Quando le cellule crescono male, il contorno viene migliorato, nel citoplasma compaiono vacuoli, goccioline lipidiche e altre particelle, lo spazio tra le cellule viene allargato e la morfologia cellulare è irregolare o addirittura perde le sue caratteristiche originali, come le cellule epiteliali che diventano come epiteliali cellule. Quando le cellule muoiono, alcuni coloranti possono combinarsi con il DNA nucleare disintegrato attraverso la membrana cellulare denaturata e renderle colorate. Pertanto, il blu trypan viene spesso utilizzato per identificare le cellule morte e vive. Le cellule viventi non si colorano e i nuclei morti sono blu.
2. Crescita cellulare dopo coltura primaria o inoculazione di sospensione cellulare in subcoltura, ha iniziato a proliferare dopo diversi periodi di incubazione. Linee cellulari di passaggio, tessuti embrionali o tessuti larvali generalmente vedono la crescita cellulare il giorno successivo e possono essere collegati in pezzi entro una settimana. Dopo che le cellule inoculate crescono su tutta la parete della bottiglia, dovrebbero essere ricoltivate in tempo. Altrimenti, a causa del consumo di nutrienti e dell'accumulo metabolico, le cellule entreranno nel periodo di arresto o degradazione. In questo momento, il contorno cellulare è migliorato e spesso compaiono depositi granulari nelle cellule, che sono mitocondri gonfi. Il citoplasma viene vacuolizzato e le cellule diventano rotonde e ruvide. Nei casi più gravi, le cellule cadono dalla parete della bottiglia. Solo subcoltivando nel tempo le cellule possono continuare a crescere e riprodursi.
3. In condizioni normali, la soluzione nutritiva è rosso pesca. Se le cellule vengono mantenute a pH 6,5 ~ 6,6, le cellule cadranno e moriranno. Quando il mezzo di coltura è acidificato e diventa giallo, indica che i metaboliti nel mezzo di coltura si sono accumulati fino a una certa quantità e che il mezzo di coltura fresco deve essere sostituito. Se HEPES viene aggiunto al mezzo di coltura o coltivato in un incubatore al 5% di co2, il pH può essere mantenuto relativamente stabile. Il tempo di cambio della soluzione nutritiva dipende dal consumo di nutrienti. Quando la cellula cresce vigorosamente, può essere cambiata ogni 2 ~ 3 giorni e quando la crescita è lenta, può anche essere cambiata ogni 3 ~ 4 giorni. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata al fatto che varie cellule hanno requisiti diversi per il valore del pH.
4. Contaminazione microbica Dopo la contaminazione microbica della coltura cellulare in coltura, il valore del pH cambierà e il mezzo di coltura apparirà torbido. Dopo l'infezione batterica, a causa del movimento dei batteri, si verifica un leggero lampo al microscopio ottico; Nell'infezione fungina sono state osservate al microscopio molte ife filamentose e talvolta spore raggruppate; La contaminazione da micoplasma può essere rilevata solo con l'aiuto di alcuni metodi di rilevamento. Dopo la contaminazione cellulare, dovrebbe generalmente essere scartato. Per linee cellulari importanti, puoi fare riferimento a monografie pertinenti per introdurre alcune misure per rimuovere l'inquinamento. Esperimenti importanti e cellule preziose dovrebbero essere coltivati e gestiti da almeno due sperimentatori indipendentemente, o da una persona in più tempi (in tempi diversi). Oltre alle condizioni sanitarie del laboratorio di coltura, l'umidità nell'aria è strettamente correlata all'inquinamento microbico. Esperimenti importanti ea lungo termine dovrebbero essere effettuati in autunno e in inverno quando l'umidità dell'aria è bassa.
Altre precauzioni:
In primo luogo, osservare frequentemente per determinare lo stato cellulare.
In secondo luogo, se aggiungere antibiotici. Questo dipende dalla situazione. Nel processo di coltura cellulare, è necessario aggiungere il minor numero possibile di impurità irrilevanti. Gli antibiotici sono anche un peso per le cellule.
Terzo, lo scongelamento del siero bovino fetale. Il siero viene generalmente conservato a - 20 ℃ e scongelato in frigorifero a 4 ℃, il che richiede molto tempo e deve essere scongelato un giorno prima.